Festés gombával II.

Emlékeztek még a Festés gombával c. bejegyzésben látható mikroszkópos képre? Nemrég sikerült egy igen szép felvételt készítenem, melyen ugyanilyen módszerrel festett sejtek láthatók.

---

Osteosarcoma sejtek FITC-falloidinnel és propidium-jodiddal festve

A képen látható sejtekben az aktin szálakat festettük FITC-falloidinnel (zöld) a sejtmagot pedig a DNS-hez kötődő propidium jodiddal (piros). Ezek a sejtek emberi osteosarcoma (csont eredetű rosszindulatú daganat) sejtek, fogászati jellegű vizsgálatokhoz használják. A minta előkészítését, festését Kerényi Farkas és Rente Tünde, a Debreceni Egyetem, Fogorvostudományi Kar, Fogpótlástani Tanszék munkatársai végezték.

Egy hiú baktérium, avagy miért fontos számunkra, hogy milyen egy baci alakja, mérete, színe

Anno 2013. szeptemberében én és a feleségem is ígéretet tettünk a Kutatók Éjszakája érdeklődőinek, hogy megosztjuk azokat a látványos és remélhetőleg érdekes dolgokat, amivel foglalkozunk. Így eljött az ideje, hogy többet megtudjatok egy érdekes baciról, a Streptomyces coelicolor-ról, melyről Szalókiné Dr. Kovács Krisztina oszt meg veletek egy-két érdekességet.

---

Egyetemi tanulmányaim során bekapcsolódtam egy kutatásba, mely a Streptomyces coelicolor nevű baktérium jobb megismerését célozza. Ezen sorok végigolvasása után garantáltan senki nem fog tudni ugyanúgy ránézni egy gyöngysorra, vagy kimenni eső után a szabadba, esetleg gyógyszert bevenni.

A Streptomyces coelicolor, és a vele egy törzsbe tartozó baktériumok a talajban élnek, és többségében a nehezen lebomló szerves anyagok eltávolításában játszanak szerepet, nem veszélyesek az emberre. Kivételek természetesen akadnak, találunk burgonyabetegséget („varasodást”) okozó, vagy mycetoma nevű humán bőrbetegségért felelős fajokat is. Régen azt hitték erről a baktériumról, hogy gomba, mivel hifákat képeznek, és spórákkal szaporodnak. Később kiderült, hogy ez csak az ún. konvergens evolúció, vagyis a hasonló körülményekhez való alkalmazkodás eredménye.

A Streptomyces-ek számos vegyületet termelnek: illékony szerves vegyületeket, gyógyászatban, agráriumban, élelmiszeriparban használt anyagokat. Génsebészeti úton pedig egyre többféle vegyület termeltethető vele, illetve távlati célként szerepelhet az olajkatasztrófák szennyeződéseinek eltakaríttatása.
A Vezúv által betemetett római városokban az emberek csontjaiból tetraciklin vegyületeket (egyfajta antibiotikum) izoláltak. Az otthagyott aszalt gyümölcsökben pedig megtalálták a Streptomyces-eket. Így a rómaiak, tudtukon kívül védekeztek a bakteriális fertőzések ellen.

A Streptomyces coelicolor egy sokat tanulmányozott modell-élőlény. 7825 gént tartalmaz, ami más baktériumok génkészletének a duplája (emberben kb. 20-25.000 gént találunk). Ez a baktérium termeli a geozmint is, amely vegyületet eső után érezzük, illetve okozza a halak „pocsolyaízét”, bizonyos angolnafajoknak pedig iránytűként szolgál a vándorláshoz.

1. ábra A Streptomyces-ek életciklusa

Az életciklust tekintve (1. ábra) először a spórák szétterjednek a környezetben, és ha a körülmények megfelelőek, a talajban megduzzadnak, csíratömlőt hoznak létre, melyből vegetatív hifa képződik. A sejtosztódásokat nem követi a harántfalak záródása, így elágazó vegetatív micéliumot képez. Bizonyos jelekre, pl. tápanyagcsökkenésre a baktérium belép a reproduktív, szaporodási szakaszba, és légmicéliumokat képez. Ebben a szakaszban záródik a harántfal, megvastagszik a sejtfal, és egyszeres genetikai állományt tartalmazó spórák jönnek létre. Nagy mennyiségű trehalózt tartalmaznak, mely vegyület védi őket a kiszáradástól. Így tudnak gyakorlatilag mindenütt szétszóródni, és a folyamat kezdődik elölről.

2. ábra A CabB fehérje szerkezete, a piros elemek a kalciumionokat jelzik

Vizsgálatainkhoz két törzset használtunk, a vadat és egy mutáns törzset, mely a CabB nevű fehérje génjében tartalmaz eltérést (2. ábra), így a fehérje - ami egyébként kalciumot köt, és a fejlettebb élőlények kalmodulin-kötő fehérjéihez hasonlít, csak feleakkora - nem jön létre. Célunk az volt, hogy a kérdéses fehérje funkcióját megismerjük, fényt derítsünk arra, hogy milyen szerepet játszik a Streptomyces coelicolor „életében”. Ezáltal is hozzájáruljunk ahhoz, hogy erről a baktériumról minél többet megtudjunk.

3. ábra Fedőlemezek alá oltott spórák, a leoltás után és néhány nap elteltével

Többféle megközelítést alkalmaztunk, amiből elsőként a mikroszkópos technikákat szeretném bemutatni. Ezek segítségével a spórázó láncok kinézetét, szerkezetét, nagyságát és számát hasonlítottuk össze. Fáziskontraszt-mikroszkópot, atomerő mikroszkópot, konfokális lézer pásztázó mikroszkópot és pásztázó elektronmikroszkópot használtunk.
A minták elkészítéséhez többféle táptalajt, tenyésztési hőmérsékletet és időt használunk, ezáltal is elmélyítve és árnyalva a különbségeket a két törzs között. A táptalajokba fedőlemezeket helyeztünk kb. 45 fokos szögben beszúrva, és azok alá oltottuk a spóraszuszpenziót (3. ábra).

4. ábra A fedőlemezekre nőtt minták eloszlása, pirossal jelöltem az általunk vizsgált területeket

Így a kész lemezeken láthatunk egy vonalat, amely alatt helyezkednek el a vegetatív-, felette a légmicéliumok, amiket keresünk (4. ábra).

5. ábra  Fáziskontraszt mikroszkópos képek: fent a vad, lent a mutáns baktériumok

A fáziskontraszt mikroszkópia lényegében megegyezik a fénymikroszkópiával, csak egy optikai módszerrel megnöveljük a minták kontrasztját, így festés nélkül is jól vizsgálhatjuk a baktériumok formáját. Az 5. ábra felső képén, melyen a vad baktériumokat látjuk, jól láthatóan több a befűződés, mint az alsó képen, melyen a mutáns bacik láthatók. Mivel a két baktériumtörzs azonos körülmények között volt tartva, azt mondhatjuk, hogy a mutáns spóraképzése lassabb, mint a vad típusé. 

6. ábra  Konfokális lézer pásztázó mikroszkópos képek: fent a vad, lent a mutáns baktériumok

Konfokális lézer pásztázó mikroszkópos vizsgálat során egy olyan festékkel tettük láthatóvá a baktériumokban, illetve a spórákban lévő DNS-t, mely a mikroszkópban vörösen világít, így kirajzolja a baktériumfonalakat és a spórákat. A látvány itt is hasonló, mint a fáziskontraszt mikroszkóppal látottak esetében, a vad törzsnél (6. ábra, felső kép) számos spórázó láncot, míg a mutáns esetében (6. ábra, alsó kép) jelentősen kevesebbet láthatunk. Különböző morfológiai eltéréseket is találhatunk, előfordul olyan spóra, mely nem tartalmaz DNS-t, vagy megfigyelhetők a spórák nagyságbeli eltérései, akár egy láncon belül is. Mérésekkel azt tapasztalhatjuk, hogy a mutáns törzs spóráinak mérete kisebb a vadéinál.

7. ábra Atomerő-mikroszkópos képek: fent a vad, lent a mutáns baktériumok egy-egy lánca

Atomerő mikroszkóppal képesek vagyunk a baktérium felszínét nagyon nagy feloldással végigpásztázni. Ilyenkor csak egy-egy baktériumfonalat vagy spóraláncot vizsgálhatunk. Jól látható, hogy a vad baktériumfonalakon teljesen lefűződtek a spórák (7. ábra felső kép), míg a mutánsokon alig látszanak befűződések (7. ábra alsó kép). 

8. ábra Pásztázó elektronmikroszkópos képek: fent a vad, lent a mutáns baktériumok láncai

Az elektronmikroszkóppal igen nagy nagyítást tudunk elérni, és így vizsgálni a baktériumfonalak kinézetét, kapcsolódásukat. Az eredmény a fentiekkel megegyező. 

9. ábra Antibiotikum-termelés összehasonlítása: egymás mellett a két baktériumtörzsből származó mintákat találjuk

Másodikként az Actinorrhodin nevű antibiotikum termelését vizsgáltuk, és hasonlítottuk össze (9. ábra). Már a folyékony táptalajok színe jelentősen különbözik, ezt mérésekkel is igazolhatjuk, és összevethetjük az előzőekben ismertetett módszerekkel.

Ezen vizsgálatokkal megfigyelhettük, hogyan viselkedik a két törzs más-más körülmények között tenyésztve, és különböző stresszhelyzeteknek kitéve. Kiderült, hogy a CabB fehérje valószínűleg szerepet játszik a baktérium differenciálódásában, légmicélium és spóra morfológiájának kialakításában, a DNS állomány spórákra elosztásában, és a stresszhelyzetekre való alkalmazkodásban és ekkor történő antibiotikum-termelésben, viszont kedvező körülmények között nem befolyásolja az Actinorrhodin-termelést.

Ezen kívül vizsgáltuk és vizsgáljuk jelenleg is, hogy mi történik, ha kivonjuk a gént és visszahelyezzük a mutánsba. Helyreáll vajon a funkció? Mi van akkor, ha túltermeltetjük a fehérjét? Milyen további fehérjék kapcsolódnak a CabB-hez? Sejtosztódáskor hol találjuk meg a fehérjét? És ha más gént ütünk ki ugyanebből a kalciumkötő-fehérje családból? Ezek a kérdések még válaszokra várnak…

A kísérletek megtervezésében és elvégzésében segítségemre voltak: Dr. Penyige András, Dr. Jenei Attila, Kompár Csilla, Bagosi Adrienn, Dr. Daróczi Lajos, Kormos József, Szalóki Gábor
Segítségüket hálásan köszönöm.

A kutatás a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú Nemzeti Kiválóság Program – Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program című kiemelt projekt keretében zajlott. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósul meg.

Festés gombával

A gyilkos galóca (Amanita phalloides). Forrás: wikipedia

Munkámat tekintve nem fényképész vagyok, viszont van lehetőségem más módon is képeket készíteni. Molekuláris biológusként sokat használok mikroszkópot, mellyel egészen közelről vizsgálhatok dolgokat. Na de ugyebár a bejegyzés címe az, hogy „Festés gombával”, szóval lássuk, hogyan jön a gomba a mikroszkóphoz. Ahhoz, hogy a mikroszkópban láthatóvá tegyünk dolgokat, meg kell őket festenünk, főleg ha fluoreszcens mikroszkópiáról van szó (hogy hogy is működik a fluoreszcens mikroszkóp, legyen egy következő bejegyzés témája, egyelőre elégedjetek meg azzal, hogy a fluoreszcens mikroszkópos képeken sötét háttér előtt „világítanak” különböző színnel a megfestett sejtek, sejtalkotók). Ahhoz, hogy olyan sejtalkotókat festhessünk meg, melyeket látni szeretnénk, olyan molekulákra van szükségünk, melyek csak a számunkra fontos sejtalkotóhoz kötődnek. És itt jön a gomba a képbe, mivel egy rettegett gombafaj, a gyilkos galóca (Amanita phalloides) egyik toxinja, a falloidin erősen és szelektíven kötődik a sejt vázának egyik alkotójához, az aktin filamentumokhoz. Persze, ezt a molekulát így még nem látnánk a mikroszkópban, ezért egy olyan molekulát kapcsolnak a toxinhoz, mely a mikroszkópban zöld színnel világít (ennek a neve egyébként fluoreszcein-izotiocianát, FITC). Így már a használható a festék, mely az aktin filamentumokat zöld színnel rajzolja ki. Emellett más színnel megfesthetünk más sejtalkotókat is, így például piros színnel a sejtmagot. Eredményképpen ilyen tetszetős képet láthatunk a mikroszkópban. Íme:

Egér fibroblaszt sejtekről készült konfokális mikroszkópos felvétel. Zöld színnel az aktin filamentumok, míg piros színnel a sejtmagban lévő DNS van megfestve

A felvétel a Debreceni Egyetem Biofizikai és Sejtbiológiai Intézetében készült.